Sipariş vermek için online sipariş sistemimize kayıt olup (order.sentebiolab.com.tr) siparişlerinizi kolayca verebilir, verdiğiniz siparişlerin üretim ve teslimat durumlarını takip edebilirsiniz. Sipariş sistemimizin kullanımı için detaylı bilgiyi aşağıda bulunan kullanım kılavuzumuzu inceleyerek edinebilirsiniz.

Standart saflaştırma ve OPC yapılan primerleriniz sentezin ertesi günü, teslime hazır olmaktadır. Sisteme girdiğiniz siparişleriniz için üretim ekibimiz sisteme kayıtlı olan mail adresine teslimat maili atmaktadır. HPLC saflaştırma yapılan primerleriniz / modifiye primer ve probe’larınız için lütfen bizimle iletişime geçiniz. Rutin sentez programımız aşağıda verilmiştir:

Saflaştırma olarak Standart (DSLT-desalting) saflaştırma, OPC ve HPLC seçenekleri mevcuttur.

Standart saflaştırma

Standart saflaştırma olarak desalting işlemi gerçekleştirilir ve primerler istenmeyen tuzlardan arındırılır. 35 baz ve daha kısa oligolar için, PCR uygulamalarında kullanılacak oligolar da dahil olmak üzere (n-1) ürünlerin önem arz etmediği birçok uygulama için bu yöntem kullanılabilir.

OPC saflaştırma

OPC yöntemi ile hatalı sekanslar (n-1 gibi), yan ürünler, kirlilikler elenir. Bu yöntem ile elde edilen primerler polimorfizm analizleri, sekans, PCR ve gen sentezi için kullanılabilir. 80 Baz uzunluğundaki nükleotidlere kadar OPC purifikasyonu tavsiye edilir.

HPLC saflaştırma

HPLC yöntemi tüm n-1 oligo yan ürünlerinden kurtulmak için en etkili yöntemdir. Klonlama çalışmaları gibi tek bazlık hataların tolere edilmeyeceği çalışmalar için tercih edilebilir. Ayrıca modifiye oligonükleotidler için de tavsiye edilen saflaştırma yöntemidir. 50 nmol- HPLC saflaştırma seçeneğinde miktar garantisi bulunmamaktadır.

Aşağıdaki tablo 100 µl PCR reaksiyonunda son primer konsantrasyonu olarak 0.1-0.5µM kullanıldığı kabul edilerek hazırlanmıştır:

Tercih edilen skala senteze başlama miktarını belirlemektedir. Saflaştırma türüne göre teslim edilecek ürün miktarı değişkenlik göstermektedir. Farklı skala ve saflaştırma türlerinde teslim edilebilecek en düşük ürün miktarı aşağıdaki tabloda verilmiştir. Bu miktarlar modifiye oligonükleotid/hidroliz probları için geçerli değildir.

Sentezlenen tüm oligonükleotidler kurutulmuş (liyofilize) halde teslim edilmektedir.

Ürünlerin renksiz olması nedeniyle kurutulmuş halde tüpte farkedilmeleri, özellikle düşük skalada, oldukça zordur. Primerler ile birlikte gönderilmiş olan üretim raporuna uygun olarak sulandırıp deneylerinize başlayabilirsiniz.

100 nmol ve 200 nmol sentezlerde ürün yoğunluğundan dolayı kurutma sonrası bu görüntü oluşabilmektedir.Primerinizi standart şekilde sulandırıp çalışabilirsiniz.

Liyofilize olarak teslim edilen primerler gönderim esnasındaki sıcaklık değişimlerinden olumsuz etkilenmez. Ancak raf ömrünü uzatmak amacıyla teslim aldıktan sonra +4⁰C/-20⁰C’de saklamanızı tavsiye etmekteyiz. Sulandırılan primerlerin saklama sıcaklığı -20 ºC dir.

Primerlerinizi uzun süreli saklamak için TE Buffer ile çözünüz ve stok primerlerinizi don-çöz yapmayınız, kullanacağınız kadar seyreltip bölünmüş porsiyonlar (aliquot) halinde muhafaza ediniz.

Primerleriniz kullanım kılavuzuna uygun bir şekilde sulandırıldı, saklandı ancak çalışmıyor ise aşağıdaki koşulları sağlaması durumunda garanti kapsamında ücretsiz olarak tekrar sentezlenecektir.

• Oligonükleotid dizisinin bir yayından alınmış olması (ilgili yayını lütfen e-mail ile bize iletiniz) ya da,
• Daha önce laboratuvarınızda rutin olarak kulllanılmakta olan bir dizi olması.

100 µM ana stok için eklenmesi gereken çözücü miktarı ürünler ile birlikte gönderilmiş olan kullanım kılavuzunda (datasheet) yer almaktadır.

Oligonükleotidleri çözmek için TE (Tris-EDTA tampon çözeltisi) veya DNaz/RNaz içermeyen su (DNase/RNase free water/DEPC water) kullanılabilir.

Kullanılacak primer konsantrasyonu çalışılacak yönteme bağlı olarak değişkenlik gösterebilir.

Rutin PCR uygulamaları için 10 µM ara stok oluşturup 25 µl PCR reaksiyonu için bu ara stoktan 0.5 µl kullanılabilir.

Primer/probe dizaynı hizmetimiz bulunmaktadır. Dizaynı bizim tarafımızdan yapılan primer/probe’lar her türlü optimizasyonu yapılıp optimizasyon raporu ile birlikte çalışır halde teslim edilmektedir.

Bunun için bu hizmeti paket halinde aşağıdaki kalemleri kapsayacak şekilde vermekteyiz:

• Primer/probe dizaynı
• PCR optimizasyonu
• Pozitif kontrol (gen fragmenti) sentezi

Aşağıdaki listede yer alan modifikasyonlara sahip oligonükleotidlerin üretimini rutin olarak yapmaktayız.

• -5’FAM
• -5’HEX
• -5’TET
• -5’JOE
• -5’ Biotin
• -5’Amine
• -5’Fosfat
• -5’Thiol
• –5’ Cy5
• –5’ TAMRA
• –3’ Biotin
• –3’ Thiol
• –3’ Fosfat
• -3’TAMRA
• -3’Amine

Eğer istediğiniz modifikasyon bu tabloda yer almıyorsa lütfen bizimle iletişime geçiniz.

• Aşağıdaki tabloda yer alan boya ve quencher’ları içeren Taqman probe’larının üretimini yapmaktayız.
• Eğer istediğiniz probe’a ait boya/quencher bu tabloda yer almıyorsa lütfen bizimle iletişime geçiniz.

• Modifiye primer/probe’larınızda kullanılacak boyaların excitation ve emission dalga boyları kullanılacak qPCR cihazının lazer ve filtreleri ile uyumlu olmalıdır.
• Cihazınıza ait lazer ve filtre bilgilerine cihazınızın web sitesi/kullanım kılavuzundan ulaşabilirsiniz.
• Modifiye primer/probe üretiminde kullanmakta olduğumuz boyalara ait excitation/emission dalga boyları aşağıdaki tabloda verilmiştir:

İstenilen herhangi bir genin veya DNA dizisinin çift sarmallı olarak ve herhangi bir referans (template) DNA’ya ihtiyaç olmadan sentetik olarak üretimini kapsamaktadır.

Hedef gen bölgesi minimum 200 bp ve maximum 1000 bp’e kadar sentetik olarak sentezlenmektedir. Belirtilen aralık dışında kalan gen bölgeleriniz için ayrıca iletişime geçmenizi öneririz.

Gen sentezi hizmetimiz için ilk olarak sentezletmek istediğiniz hedef bölgenin sekans dizisini info@sentebiolab.com.tr adresine mail göndererek dizinin senteze uygunluğunun kontrol edilmesi ve proforma talebinde bulunmanız gerekmektedir.

Gen Sentezi hizmetimiz mutasyonlu/mutasyonsuz olmak üzere iki ayrı opsiyondan oluşmaktadır. Mutasyonlu gen sentezinin teslim süresi 4 haftayı, mutasyonsuz gen sentezlerinin teslim süresi 6 haftayı bulmaktadır.

Mutasyonlu sentetik gen üretiminde dizi içerisinde mutasyon içerme olasılığı mevcuttur. Mutasyonsuz sentetik gen üretiminde dizi herhangi bir şekilde mutasyon içermemektedir. Mutasyonsuz olan gen sentezi hizmetinde sentezlenen dizinin doğruluğu sekanslama yöntemi ile kontrol edilmektedir.

Üretilen sentetik gen vida kapaklı tüp içerisinde en az 30 µl hacimde, pJET1.2 klonlama vektörü içerisinde sıvı olarak gönderilmektedir.

Sentezletmek istediğiniz dizinin sentezi yüksek GC konsantrasyonu, fazla miktarda tekrar dizilerinin mevcudiyeti, hairpin yapan bölgeler gibi sebeplerden dolayı mümkün olamayabilir. Böyle bir durum ile karşılaştığımızda ilgili problemler tarafınıza belirtilip mümkün ise bu problemler giderilecek şekilde dizinin düzenlenmesini beklemekteyiz.

Gen Sentezi hizmetimizde mail ile tarafınıza üretilen genin içinde bulunduğu plazmid haritasını içeren Snapgene dosyası ve mutasyonsuz seçenek için ayrıca DNA dizileme sonuçları iletilmektedir. Nanodrop ölçüm sonuçları kargo ile tarafınıza gönderilen örnek ambalajında belirtilmektedir. Ayrıca bir raporlama mevcut değildir.

Yeni Nesil Dizileme hizmeti için doldurulacağınız sipariş formumuzu info@sentebiolab.com.tr mail adresine gönderilerek proforma talebinde bulunmanız gerekmektedir. Proformanın onaylanmasını takiben örneğiniz işleme alınmaktadır.

Kargo taşımacılığı esnasında örneğinizin dökülme ve çarpmalara karşı korunacağından emin olarak korunaklı bir şekilde yollamanız gerekmektedir. Kargo taşımacılığı sırasında oluşabilecek herhangi bir hasarda firmamız sorumluluk kabul etmemektedir. PCR/Plasmid örneklerinde herhangi bir soğuk zincire gerek duyulmamaktadır. Örnek konsantrasyonunun minimum 50 ng/µl, örnek hacminin minimum 25 µl olması gerekmektedir.

25kb uzunluğa kadar örneklerinizin dizilenmesi gerçekleştirilmektedir.

Yeni Nesil Dizileme hizmeti için herhangi bir primer göndermeniz gerekmemektedir.

Tarafımıza göndereceğiniz referans sekans dizisini  .fasta veya .docx dosya uzantıları şeklinde gönderebilirsiniz.

Analiz edilen örneğinizin okuma sonuçları vermiş olduğunuz referans dizi üzerinde birleştirilerek consensus.fa dosyası olarak gönderilmektedir. Bu dosya formatı haricinde herhangi bir türde gönderim gerçekleşmemektedir. Örnek miktarlarınıza ve siparişlerimizdeki yoğunluğa bağlı olarak sonuçların tarafınıza ulaşması 1-2 hafta sürmektedir.

Hizmetimizde herhangi bir raporlama hizmeti mevcut değildir, yalnızca consensus.fa dosyası şeklinde sonucunuzu göndermekteyiz.

İyi bir analiz sonucu alabilmek için öncelikle sipariş formunu eksiksiz ve doğru bir şekilde doldurarak, agaroz jel görüntüsü ile birlikte yukarıda belirttiğimiz mail adresine göndermeniz gerekmektedir. Örnek kaliteniz ve doğru referans dizisini sağlamanız analiz esnasında kaliteli ve doğru bir sonuca ulaşmanız için önem arz etmektedir. Aksi takdirde kaliteli bir okuma elde etmek mümkün olmamaktadır.

Saflaştırılmış PCR ürünleri için DNA konsantrasyonu en az 30 ng/uL ve plasmid ürünleri için DNA konsantrasyonu en az 80 ng/ul olmalıdır ve en az 25 uL olarak bize iletilmelidir. Saflaştırılmamış PCR ürünleri 30 ul PCR reaksiyonu olarak gönderilmelidir.

Sekans formundaki ve tüp üzerlerindeki isimlendirmeler (örnek ve primer isimleri) birbiri ile aynı olmalıdır. Tüm örnek ve primerler 0.2 ml tüplerde, ağızları parafilmle kapatılarak 15 ml yada 50 ml falkon tüp içerisinde pamuk vb ile sabitlenerek gönderilmelidir. Sızıntı, örnek buharlaşması ve çapraz-kuyu bulaşması durumunun engellenmesi için numunelerin doğru şekilde hazırlanması gerekmektedir. Kargo esnasında gerçekleşen sızıntı, dökülme ve çarpraz bulaşmalardan Sentebiolab sorunlu değildir. Örnekler kargoya verildikten sonra sipariş formu ve jel görüntüsü mail ile gönderilmelidir.

Sanger sekans için gönderilecek olan primerler 10 uM konsantrasyonda ve en az 10 uL gönderilmelidir.

Primer ve DNA örnekleri sadece nükleaz içermeyen ddH₂O içerisinde sulandırılmalıdır. DNA kesinlikle EDTA’lı solüsyon içerisinde çözülmemelidir. EDTA sekans reaksiyonunda inhibe edici özelliğe sahiptir ve dizilemenin başarısız olmasına neden olmaktadır.

Sekanslama için kullanılacak primerlerin uzunlukları 25 bazdan fazla olmamalıdır.

Tek yönlü en fazla 650 bp, çift yönlü en fazla 1300 bp okuma yapılabilir. Dizinin 90 bp’den uzun olması gerekmektedir.

Jel görüntüsünde birden fazla bant olan veya silik banta sahip PCR ürünleri sekanslamaya alınsa bile garanti kapsamına alınmaz. Birden fazla amplikonun görüldüğü durumlarda uygun boyuta sahip PCR ürününün jel ekstraksiyonu ile saflaştırılmasını tavsiye ediyoruz. Ancak jel ekstraksiyonu ile elde edilen konsantrasyon genellikle düşük olduğundan sekans için başarı garantisi bulunmamaktadır.

Primer sentezi esnasında yan ürün olarak üretilen kısa dizilerin de sekans reaksiyonuna dâhil olmaları karışık sekans kromatogramlarına neden olmaktadır. Bu nedenle sekans primerleri için kısa dizileri uzaklaştırmayı sağlayan OPC/HPLC saflaştırma yöntemleri tercih edilmelidir.

Bu problem Sanger dizilemede oldukça sık görülen, “dye blob” olarak adlandırılan bir durumdur. Kesin nedeni bilinmemekle beraber sekans reaksiyonu esnasında kullanılan boyalı nükleotid kaynaklı bir durumdur ve çoğunlukla okunan nükleotidlerin anlaşılmasına engel olacak bir durum oluşturmaz.

Dizi reaksiyonunun neden başarısız olduğunun kesin nedenini belirlemek zordur. Yaygın bazı nedenler ve bunların nasıl düzeltileceği aşağıda verilmiştir:

-Kalıp DNA konsantrasyonu çok düşük olabilir. Bu durum sekans reaksiyonunun başarısız olmasının bir numaralı nedenidir.

– Düşük kalitede DNA (A260/280 ve A260/230 değerleri ile belirlenmiş), dizilemenin başarısız olmasına neden olmaktadır.

-Kontaminantlar iyi dizi verilerinin elde edilmesini büyük ölçüde engeller.

-Fazla tuzlardan, kirletici maddelerden ve PCR primerlerinden kurtulmak için DNA’nın temizlediğinden emin olunmalıdır.

-Çok fazla miktardaki kalıp DNA dizi reaksiyonunu öldürebilir.

-Kalıba hatalı veya yanlış primer eklenmesi dizi reaksiyonunun başarısız olmasına neden olur.

-DNA/primerler içerisinde EDTA gibi inhibe edici moleküllerin varlığı sekans reaksiyonunda başarısızlık sebebidir. Özellikle plazmid izolasyonu esnasında kullanılan “elution buffer” içeriklerinde EDTA yer alabilmektedir. Sanger sekansda kullanılacak olan plazmidlerin izolasyonu sırasında son basamakta su ile çözmeyi tavsiye etmekteyiz.

Bu durum sekans reaksiyonu sırasında birden fazla ürün elde edildiğini göstermektedir ve başlıca iki sebebi vardır:

-DNA örneği saf değildir, içerisinde birden fazla ürün bulunmaktadır (örn: jelde 2 bant veren PCR örnekleri),

-Sekans primerleri saf değildir, içerisinde sentez esnasında yan ürün olarak meydana gelmiş olan kısa diziler (n-1, n-2 gibi) yer almaktadır.

Sanger sekans sonuçları Snapgene ile de görüntülenebilen .ab1 uzantılı dosya formatında gönderilmektedir.

Sanger sekans sonuçları bir hafta içerisinde çıkmaktadır.

Saflaştırılmamış PCR ürünlerinin içerisinde bulunan primer ve dNTP’ler sekans reaksiyonuna da dahil olmakta ve başarısız sonuca neden olmaktadır. Bu nedenle saflaştırılmamış PCR ürünleri ile sekans yapmamaktayız.